• Culturi celulare
• Masuratori electrofiziologice (patch-clamp, voltage clamp, Ussing, analiza fluctuatiilor in curentul ionic transepitelial, bistrate lipidice artificiale)
• Masurarea concentratiei ionilor prin imagistica cu fluorescenta

• Microscopie de forta atomica
• Tehnica Langmuir-Blodgett

Incubator cu CO2 Heraeus, hota cu flux laminar 3 instalatii de masurare a curentilor ionici prin canale unice (patch-clamp) 2 microscoape inversate dotate pentru imagerie cu fluorescenta Microscop de forta atomica Software specializat: p-clamp pentru PC pentru achizitionarea curentilor ionici, curbelor I-V si prelucrare Axon Imaging work Bench - pentru imagerie ionica Interactive Data Language - analysis

• Functionarea moleculelor membranare cu functie de canal ionic, transportor sau pompa ionica
• Caracterizarea mutantelor celulare obtinute prin tehnici de biologie moleculara d.p.v. al fluxurilor ionice transmembranare
• Explorarea mecanismului proceselor fiziologice in care sunt implicate canale ionice, transportori sau pompe ionice
• Investigarea structurii tridimensionale a biosuprafetelor si biomacromoleculelor

• Culturi celulare
  Mentinerea celulelor in culturi pe perioade indelungate de timp, in conditii care sa permita efectuarea de masuratori cu usurinta. Aici exista doua abordari majore. In primul rind, celulele pot fi preluate de la un animal si tinute in incubator timp de pina la o luna (cultura primara). In al doilea rind, exista disponibile linii celulare clonate, care se divid si cresc continuu (provenind din celule tumorale); fiind clone, celulele sint identice genetic. Fiecare din abordari are propriile avantaje, in functie de scopul ales: culturile primare sint mai apropiate de starea fiziologica normala, in timp ce liniile celulare permit standardizarea lucrarilor efectuate in mai multe laboratoare.
• Masuratori de fluxuri ionice prin canale prin metoda patch-clamp
  TEste o tehnica ce permite inregistrarea comportamentului electric (potential de membrana, fluxuri de Na, K, Cl, Ca) in celule intregi sau in fragmente mici de membrana (patch � petic). Aceasta metoda electrofiziologica foarte sensibila, ai carei descoperitori au fost rasplatiti cu premiul Nobel in 1991, a devenit un standard in laboratoare din intreaga lume. Aceasta metoda, care permite observarea functionarii in timp real a unei singure molecule proteice din membrana, ofera raspunsuri directe la intrebari despre canale de genul: Cat curent trece printr-un singur canal? Cat de mult poate sa stea deschis un canal? In ce masura deschiderea sau inchiderea sa depind de voltaj? De molecula de activare? Tehnica patch-clamp implica atasarea varfului unei pipete de sticla (diametrul interior este de ordinul micronilor) de membrana unei celule. Tehnica poate fi folosita cu rezultate foarte bune pe celule izolate aflate in culturi celulare sau pe transe de tesut. In conditii ideale, o usoara aspirare prin pipeta duce la formarea intre marginea varfului pipetei si membrana celulara a unei legaturi foarte stranse. Controlata prin pulsuri electrice, aceasta legatura se dovedeste a avea o rezistenta de ordinul a 109 ohmi (gigaohmi). Daca pipeta este racordata la un amplificator corespunzator, se pot inregistra curentii electrici generati de fluxurile ionice transmembranare prin bucatica de membrana fixata pe varful micropipetei. Aceste evenimente sunt reprezentate de pulsuri rectangulare de curent care reflecta deschiderea si inchiderea canalelor unice. In forma lor cea mai simpla, pulsurile de curent apar neregulat, cu amplitudini aproape identice dar de durate diferite. De cele mai multe ori insa, curentii releva stari deschise cu mai multe stari conductive sau cu o cinetica complicata. In concluzie, tehnica de patch-clamp ne permite sa masuram (1) amplitudinea curentilor printr-un singur canal si (2) comportamentul cinetic al canalelor.

   

• Imagistica prin fluorescenta
  TCelulele din cimpul unui microscop sint injectate cu un colorant (fluorocrom) care isi modifica caracteristicile de fluorescenta ca raspuns la semnalele celulare (o schimbare de concentratie a unui ion, cum ar fi Ca2+ sau Na+, de pH sau potential membranar). Semnalul luminos este inregistrat cu o camera video conectata la un computer care va calcula modificarile parametrilor fiziologici. Combinatia intre metodapatch-clamp si masuratorile ionice de fluorescenta permite lamurirea proceselor implicate in semnalizarea celulara. Multe celule folosesc pentru semnalizarevariatii ale potentialului membranar. Exemple pentru evenimente care declanseaza astfel de semnale pot fi: pentru o celula secretoare - interactia dintre o substanta stimulatoare si un receptor membranar;pentru o celula senzoriala ce detecteaza distrugere tisulara (nociceptor) evenimentele relevante ar putea fi temperatura excesiv de mare, prezenta unei substante iritante sau prezenta unor compusi eliberati de celulele distruse. Aceste schimbari ale potentialului membranar duc la modificari ale concentratiilor ionice intracelulare, ionul cel mai important implicat in semnalizarea celulara fiind cel de calciu (Ca2+). Exista si alte cai de semnalizare, ce implica ioni intracelulari ,tot Ca2+, care sint independente de potentialul de membrana. Aceleasi semnale de baza (potential de membrana, [Ca2+ ] ) sunt utilizate de o larga varietate de tipuri celulare, subordonate mai multor functii fiziologice.

Date de contact:
Telefon:+40 01 411 9695

Fax:+40 01 411 933
E-mail: flonta@bio.bio.unibuc.ro